技术研发
鹍远生物最新成果：新一代血液甲基化检测技术助力早期肝癌诊断和预后评估
近期国际临床转化期刊Clinical and Translational Medicine（IF 10.6）上刊载了由复旦大学附属中山医院樊嘉院士、周俭教授和杨欣荣教授团队、联合鹍远生物、福建医科大学孟超肝胆医院刘小龙教授团队等的重要研究成果[1]：“Early detection and prognosis evaluation for hepatocellular carcinoma by circulating tumour DNA methylation: A multicenter cohort study（通过循环肿瘤DNA甲基化对肝细胞癌进行早期检测与预后评估的多中心队列研究）”。该研究系2019年复旦大学附属中山医院牵头，联合鹍远生物等多家单位共同申报的“国家重点研发计划-重大慢性非传染性疾病防控研究专项：基于液体活检技术的常见恶性肿瘤筛查及早诊技术研发与评价研究”的系列研究成果之一。
原发性肝癌在所有癌症的死亡率中高居中国第二位、全球第三位[2]，其中肝细胞癌（HCC）约占80％[3]。目前肝癌的发病率和死亡率仍在不断上升，导致全球公共卫生负担沉重[4]。早诊早治在进一步提升肝癌总体疗效中作用关键[5-8]。目前用于HCC诊断的策略，无论是血清甲胎蛋白（AFP）还是超声，都缺乏足够的灵敏度和特异性，尤其是对于早期HCC[9, 10]。因此，亟需研发高灵敏度、高特异性、经济有效的诊断工具，以进一步改善HCC患者的总体预后。
本研究通过对HCC的癌与癌旁进行了全基因组甲基化检测，鉴定出HCC的差异性甲基化区域（differentially methylated region，DMR），进一步从中筛选出效果最好的二十个DMRs，并将其纳入多位点qMSP检测模型（HepaAiQ）中。HepaAiQ模型经过训练，能够将293名HCC患者（BCLC 0/A期，224例）与266名对照组区分，包括慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC）、良性肝病变（BHL）和健康对照（HC）。该模型在HCC中的灵敏度为86.0％，在对照组中的特异度为92.1％，曲线下面积（AUC）为0.944；进一步在523名的验证队列中进行验证，HepaAiQ模型的AUC为0.940，在205例HCC病例中的灵敏度为84.4％（BCLC 0/A期，167例），在318名对照中的特异度为90.3％。在另一个早期肝癌的独立测试集中评估时，HepaAiQ模型在65例BCLC 0/A期（44例0期，21例A期）的HCC患者中显示了70.8％的灵敏度，对于124例CHB/LC患者的特异度为89.5％。此外，对103例HCC患者的术前和术后血浆样本进行了HepaAiQ模型评估，并与患者2年的预后结果相关联，我们发现术后HepaAiQ评分高的患者显示出更高的复发风险（风险比HR=3.33，P<0.001）
「研究设计」
该研究设计了三个阶段（图1）：标记物的发现与优化，HepaAiQ模型构建与验证，以及临床应用。
第一阶段：标记物的发现与优化。首先，基于RRBS和TCGA数据库，筛选排名靠前的DMRs，并使用HCC癌和癌旁，白细胞进行qMSP验证，对表现最佳的20个标记进行了优化。基于这些标记开发了基于血液的多位点qMSP检测方法HepaAiQ。
第二阶段：HepaAiQ模型与构建。在559名患者中（293例HCC（早期占比76.5%），266例对照组）建立了用于早期HCC检测的HepaAiQ模型，并在一个独立的523名患者队列中进行了验证。
第三阶段：HepaAiQ的临床运用，将HepaAiQ模型应用与现有血清检测方法的比较，早期肝癌的独立测试集和手术切除病人中的进行验证。
图1 研究设计
「结果」
在RRBS和TCGA数据分析时，我们通过HCC癌与癌旁或健康血浆的三次独立比较，根据采用的p值、甲基化分位数和CG富集程度对HCC组织中高度代表性的DMRs进行了排序，以滤除背景噪声较高的标记物。最后，与所有其他对照相比，我们在癌症样本中发现了183个常见的高甲基化DMRs。我们用qMSP筛选并验证了20个最有效的标记，并将其纳入多位点qMSP分析，形成HepaAiQ模型。
为建立HCC诊断的HepaAiQ模型，训练集纳入了293名HCC患者、96名CHB/LC患者、23名BHL患者和147健康对照，其中BCLC 0/A期（CNLC I期）HCC患者的比例高达76.5%。所得HepaAiQ模型的AUC为0.944（图2），对应于HCC的敏感性为86.0%，CHB/LC、BHL和HC的特异性分别为90.6%、100%和91.8%。验证集纳入了523例患者，其中HCC患者含81.5%的早期HCC。验证集中HepaAiQ的AUC为0.940，HCC的灵敏度分别为84.4%，CHB/LC、BHL和HC的特异性分别为88.0%、92.2%和90.5%。值得注意的是，在训练集和验证集中，HepaAiQ模型对早期HCC的敏感性分别为83.0% / 80.8%，对小于2 cm的肿瘤的敏感性分别为75.6% / 77.8%，对单个肿瘤的敏感性分别为83.9% / 82.9%。结果表明HepaAiQ模型在HCC早期检测和鉴别诊断中具有强大的应用潜力。
图2. HepaAiQ模型的训练和验证。
研究系统对比了HepaAiQ模型是否比现有的HCC血液检测更有优势。在489名HCC患者中，HepaAiQ的性能显著优于AFP（85.3% vs. 55%）（图3），在247名对照组中显示了相当的特异性。值得注意的是，在189名AFP结果为阴性的早期HCC患者中，HepaAiQ的敏感性为75.1%。类似地，HepaAiQ在441名患者中的性能也优于DCP。这些结果表明甲基化标记物能准确捕获HCC信号，能够提高临床监测的有效性。
图3. HepaAiQ、AFP和DCP检测HCC的性能比较。
单独采集并进行检测分析的独立测试集结果显示，HepaAiQ对高风险人群中早期HCC的敏感性为70.8%，特异性为89.5%，显示出早期HCC筛查的潜在应用前景。
此外，本研究还纳入了103名接受HCC切除手术患者进行预后评估（图4）。结果表明：术后随访中，47例出现复发，56例未复发；和术前相比，术后一个月HepaAiQ法检测到的ctDNA甲基化水平显著下降，阳性率从78.6%下降至33.0%；Kaplan-Meier生存分析表明，术后ctDNA阳性患者预后较差，复发率显著增高（HR=3.33；95% CI：1.87-5.92，p < 0.001）；多因素分析证实术后ctDNA阳性状态是预测术后复发的独立预后指标。
图4. HepaAiQ模型的预后评价。
「小结」
本研究研发出一种经济实惠、易于操作的多基因qMSP检测（HepaAiQ模型），发现了一种新型的血浆ctDNA甲基化模式，用于HCC的早期诊断和患者预后评估。HCC患者血浆的特定ctDNA甲基化模式在HCC的早期检测中性能出色，特异性和灵敏度均高于AFP和DCP。这种ctDNA检测方法可有助于进一步提升HCC患者早期诊断，并且可能为预防性筛查和疗效监控提供了一个更便捷的监测工具。
「参考文献」
[1] Guo, D.-Z., et al., Early detection and prognosis evaluation for hepatocellular carcinoma by circulating tumour DNA methylation: A multicentre cohort study. Clinical and Translational Medicine, 2024. 14(5): p. e1652.
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[5] European Association for the Study of the Liver. Electronic address, e.e.e. and L. European Association for the Study of the, EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatocellular carcinoma. J Hepatol, 2018. 69(1): p. 182-236.
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