近日，复旦大学附属中山医院刘凌晓教授团队，中日友好医院钟定荣教授团队、陈皇教授团队联合鹍远生物，通过全面分析甲状腺良恶性结节的DNA甲基化谱，发现两者具有不同免疫应答模式，并利用15个免疫应答相关基因的DNA甲基化标志物开发了一种新型的诊断工具MeIS。相关研究成果在线发表于内分泌和代谢领域的国际权威期刊Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism (IF 5.0) [1]。

甲状腺癌的发病率近年来持续升高，目前已跃居我国恶性肿瘤发病率的第三位，其中绝大部分为乳头状甲状腺癌（>80%）[2]。细针穿刺活检（FNAB）是筛查和诊断甲状腺结节的金标准方法。尽管其准确性较高，但仍有约20%的甲状腺结节的良恶性无法在细胞学上被确诊[3]。通常建议对可疑病变施行甲状腺切除术；然而，大多数情况在手术后的评估中会被确诊为良性。因此，这些患者会接受不必要的手术，并需要终身进行甲状腺激素替代治疗。现有的甲状腺结节分子诊断技术仍然存在应用的局限性。因此，在临床实践中引入更准确的甲状腺癌诊断技术将有助于减少过度诊断，降低相关的医疗负担。

「研究亮点」

1. 通过分析甲状腺乳头状癌（PTC）和良性甲状腺结节（BTN）的甲基化谱，发现了PTC与BTN中免疫微环境相关的差异甲基化模式。

2. 十五个免疫应答相关基因的DNA甲基化标志物能够在公共数据集以及回顾性手术（组织）样本和细针穿刺活检（组织）样本队列中有效且稳定地区分PTC和BTN。

3. 免疫应答相关甲基化特征是对BRAF基因突变检测的有益补充，两者结合使用可以提高细胞学意义不明确的甲状腺结节诊断的灵敏度。

「研究方法」

本研究分析了来源于GSE107738的RRBS数据（Yim队列），揭示了PTCs和BTNs之间的DNA甲基化调控差异，表明存在不同的免疫应答。利用Yim队列的训练集数据作为基准，建立了ImmunoScore，能够区分PTCs和BTNs，并随后评估其在验证集样本中的性能。利用Yim训练集中BTNs和PTCs免疫应答基因的差异甲基化区域（DMRs），开发了MeIS（一个包含十五个标记的甲基化分类器），并分别在Yim验证队列（手术组织）、ZS回顾性队列（手术组织）和ZS术前队列（FNAB组织）中评估其性能（图1）。

图1. 研究概览

「研究结果」

甲基化组差异甲基化及去卷积分析揭示良恶性甲状腺结节间不同的免疫应答

利用非负矩阵分解算法对Yim队列所有样本的甲基化组进行去卷积分析，发现队列样本的甲基化组主要由三个组分构成。其中组分1和组分3的特异性甲基化位点相关基因都在免疫应答相关功能显著富集 (adjusted P< 0.05，图2)。研究者鉴定了220个良恶性结节的差异甲基化区域（DMR）。DMR相关基因在免疫应答生物过程和信号转导通路功能显著富集。这些发现表明，BTN和PTC间不同的甲基化模式可能反应了两者间不同的免疫微环境。

图2. 良恶性甲状腺结节间不同的甲基化模式和免疫应答

免疫应答相关基因甲基化标志物能有效鉴别良恶性甲状腺结节

经过特征筛选，利用15个免疫应答相关基因甲基化标志物在训练集样本中构建了良恶性结节分类器（MeIS）, 并在验证集样本中进行了验证。MeIS在训练集5折交叉验证的平均ROC曲线下面积为0.96 (图 3A)。 在验证集中，ROC曲线下面积为0.98，敏感性为100%, 特异性为84%, PPV为87%, NPV 为100% (图 3B)。

图3. MeIS模型的ROC曲线.

MeIS模型在两个独立单盲测试队列中均展示了稳定的诊断性能

为验证MeIS模型的稳定性，研究者分别在手术样本队列及FNA样本队列中进行了单盲测试。在ZS回顾性队列中，收集了68例术后组织FFPE样本，包括50例 PTCs和18例 BTNs。MeIS模型的ROC曲线下面积为0.89 (敏感性= 92%, 特异性 = 83%, PPV = 94%，NPV = 79%；图4)。在ZS术前队列中，纳入了61例FNA样本。MeIS 在这个队列中也展示稳定的诊断性能，ROC曲线下面积为0.90 (敏感性 = 84%, 特异性 = 83%, PPV = 84%, NPV = 83%；图4)。

图4.两个独立验证队列中MeIS的诊断性能

MeIS整合BRAFV600E突变检测能有效诊断细胞学意义不明确甲状腺结节

在细胞学意义不明确的样本中，MeIS在两个独立测试队列中都表现出了一致的诊断性能(图5A)。整合BRAFV600E检测结果和MeIS的模型（Comb）能进一步提高诊断的灵敏度(在Yim测试集, ZS回顾性队列和ZS 术前队列中，敏感性分别达到100%, 98% 和 87%，图5B)。

图5.细胞学意义不明确样本中MeIS的诊断性能

「结语」

本研究利用15个免疫应答相关基因的DNA甲基化标志物开发了甲状腺结节的诊断工具MeIS。MeIS显示了稳定的性能，在三个独立验证队列中达到0.89~0.98的ROC曲线下面积。此外，在细胞学意义不明确的甲状腺结节中，MeIS和BRAF突变检测互为补充，整合两种检测结果后灵敏度提高至87%-100%。良好的诊断性能和较少的标记物总数揭示了其临床应用的潜力。本研究为进一步开发满足临床需求的低成本，高性能甲状腺结节诊断试剂盒奠定了基础。

「参考文献」

[1] Chen H, Liu YY, Wang FH, et al. 2024. MeIS: DNA Methylation-Based Immune Response Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 00, 1–10. https://doi.org/10.1210/clinem/dgae14

[2] Han BF, Zheng RS, Zeng HM，et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. Journal of the National Cancer Center. Volume 4, Issue 1, 2024, Pages 47-53.

[3] He YP, Xu HX, Zhao CK, et al. Cytologically indeterminate thyroid nodules: increased diagnostic performance with combination of US TI-RADS and a new scoring system. Sci Rep. Jul 31 2017;7(1):6906. doi:10.1038/s41598-017-07353-y

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