技术研发
鹍远生物最新成果：开发甲基化标志物辅助肺结节良恶性鉴别诊断
近日，上海交通大学医学院附属上海胸科医院孙加源教授团队，复旦大学上海癌症中心李媛教授团队联合鹍远生物，通过全面分析肺良恶性结节的DNA甲基化谱，发现能够区别这两类结节的差异性DNA甲基化区域，并开发了一种基于甲基化靶向测序技术的新型肺结节诊断工具LUNG-TRAC。相关研究成果以“Non-invasive diagnosis of pulmonary nodules by circulating tumor DNA methylation: A prospective multicenter study”为题，在线发表于聚焦呼吸系统癌症的国际期刊Lung Cancer（IF 4.5)[1]。
低剂量计算机断层扫描（LDCT）对早期恶性肺结节具有高灵敏度，因此广泛用于检测早期肺癌。但LDCT也有很高的假阳性率，例如的国家肺癌筛查试验（NLST）研究发现LDCT对良性肺结节的假阳性率可以高达96.4%[2]，导致了一定数量的不必要的手术治疗。因此，临床上有必要对LDCT检测到的结节进行进一步的恶性风险预测和分层，用于辅助后续的医疗决策（手术或随访）。目前临床上已经开发的几种非侵入性肺结节恶性风险预测和分层模型，如Mayo诊所模型（Mayo模型）[3]和退伍军人管理局模型（VA模型）[4]等，在验证研究中的准确性还有不小的改进空间。因此，在临床实践中引入更准确的肺结节风险预测和分层技术将有助于减少过度诊断，降低相关的医疗负担。
「研究亮点」
3. 进行LUNG-TRAC单中心和多中心单盲性能验证，证明该模型保持了对良性肺结节的高特异性，能够减少不必要的手术干预，而且总体性能显著优于Mayo和VA模型。
「研究方法」
该研究共包括四个阶段（图1）：标记物的发现与优化，LUNG-TRAC模型构建与验证，单中心和多中心单盲测试（图1）。第一阶段：标记物的发现与优化。首先，使用RRBS技术，对肺癌组织和良性肺结节组织进行全基因组甲基化进行测序和分析，发现能够区分良性和恶性肺结节的DMR，并选取其中80个与其他来源的甲基化标志物一起作为标志物，被开发为甲基化靶向测序panel。第二阶段：训练并验证LUNG-TRAC模型。使用上述panel，对183例来自上海胸科医院的良性或恶性肺结节患者的cfDNA进行检测，并根据panel中标志物在两类cfDNA中甲基化水平的差异训练肺结节风险预测和分层模型LUNG-TRAC，并在一个62名患者队列中进行了验证，并与Mayo和VA风险分层模型比较性能。第三阶段：单中心测试LUNG-TRAC性能。使用LUNG-TRAC对61例来自上海胸科医院的独立肺结节患者队列的cfDNA进行检测并以单盲方式预测这些结节的良恶性，并继续与Mayo和VA风险模型比较性能。第四阶段：多中心测试LUNG-TRAC性能。使用LUNG-TRAC对95例来自4家不同的医院的肺结节患者队列的cfDNA进行检测，并以单盲方式预测良恶性。
图1：研究流程概述
「研究结果」
1.发现能够区分良性和恶性肺结节组织的DMR
使用RRBS技术，对30例肺癌组织和24例良性肺结节组织进行全基因组甲基化进行测序。并在多次尝试后，选定PDR（Proportion of Discordant Reads）作为衡量甲基化水平和模型的定量指标，对这些肺结节组织的甲基化图片进行分析和比较，从中发现了近7000个能够区分良性和恶性肺结节的DMR。进一步选出其中80个高置信度的DMR，与其他来源的甲基化标志物一起组成760个标志物，用于开发肺结节风险预测和分层的甲基化靶向测序panel。
图2：（A）无监督聚类分析和（B）主成分分析均显示从RRBS数据中选出的80个DMR能将良性结节、腺癌（ADC）和鳞状细胞癌（SCC）组织清晰地分离。
2.LUNG-TRAC模型训练、验证和单中心测试结果显示其具有较好的泛化性能
306个来自上海胸科医院的肺结节病例用于风险分层模型开发。肺结节的径长范围为5-30毫米。这些患者被随机分为三个队列：训练集（N=183）、验证集（N=62）和单中心测试集（N=61）。各集合成员的组成见图1，注意每个集合中不仅包括病理确诊的早期肺癌（原位癌至IB期，简写为PMal）和良性肺结节（简写为PBe），还包括根据临床指标、专家会诊和长期随访结果诊断的恶性肺结节（简写为CMal）和良性肺结节（简写为CBe）。
首先使用甲基化靶向测序panel检测训练集患者（39个CBe、20个PBe、37个CMal和87个PMal）的cfDNA样本，并确定所有标志物的PDR值，并探索了多种建模方法中它们的分类能力，最终确定使用逻辑回归（logistic regression，简称LR）方法建立肺结节恶性风险预测和分层模型。在测试了不同的LR阈值和建模参数组合后，并测试了每种组合训练出来的模型后，对训练集样本具有最高分类准确性的模型（AUC=0.973，灵敏度=94.4%，特异性=88.1%）被选定用于后续验证和测试，并命名为LUNG-TRAC。
LUNG-TRAC的良恶性肺结节预测性能首先在一个独立的62个血浆样本队列（12个CBe，7个PBe，8个CMal和35个PMal）进行了验证，其AUC值为0.810（灵敏度=74.4%，特异性=73.7%）（图3）。随后使用另一个独立的包括61个血浆样本（12个CBe，9个PBe，5个CMal和35个PMal）的队列对LUNG-TRAC进行了单盲测试，其AUC值0.815（灵敏度=67.5%，特异性=76.2%）。可见LUNG-TRAC在验证集和单中心测试集中显示出稳定的性能，其对肺结节良恶性的预测灵敏度和特异性较为一致，提示该模型有较好的泛化能力。
图3：（A）LUNG-TRAC模型在训练集、验证集和单中心测试集中对肺结节cfDNA样本良恶性预测结果的ROC曲线和AUC值（B）LUNG-TRAC模型对训练集、验证集和单中心测试集中良性肺结节和肺癌患者cfDNA样本的恶性程度预测值的分布情况，和良性-恶性结节样本之间分值差异的显著性。
3.多中心测试证明LUNG-TRAC模型对良性肺结节样本具有较高的特异性
为了进一步评估LUNG-TRAC的准确性和稳定性，LUNG-TRAC对来自四家医院（上海胸科医院、无锡第二人民医院、浙江大学医学院附属邵逸夫医院和河南省人民医院）的由95名肺结节患者（12个CBe、14个PBe、3个CMal和66个PMal）组成的前瞻性队列进行了盲测。这次测试中，LUNG-TRAC对肺结节良恶性预测的AUC值为 0.761（灵敏度=50.7%，特异性=80.8%）（图4），这与验证和单中心测试的结果一致（AUC分别为0.810和0.815）。重要的是，LUNG-TRAC在多中心测试中保持了高特异性（80.8%），与验证集和单中心测试集的表现非常一致（特异性分别为73.7%和76.2%），证实了该模型对良性结节具有较好的特异性，能够有效地减少将良性结节误诊为恶性的发生。
图4：（A）LUNG-TRAC模型在多中心测试集中对肺结节cfDNA样本良恶性预测结果的的ROC曲线和AUC值（B）LUNG-TRAC模型对多中心测试集中良性肺结节和肺癌患者cfDNA样本的恶性程度预测值的分布情况，和良性-恶性结节样本之间分值差异的显著性。
4.LUNG-TRAC对肺结节恶性风险预测和分层的性能显著由于Mayo和VA模型
Mayo模型和VA模型均使用临床信息和放射学特征，如年龄、吸烟史、结节大小、位置和形状，作为模型参数来量化肺结节恶性风险。其功能与LUNG-TRAC基本相同。
在本研究中，Mayo模型和VA模型在验证集中的AUC分别为0.564（灵敏度=47.6%，特异性=57.9%）和0.539（灵敏度=33.3%和特异性=63.2%，图5B）。在单中心测试中，Mayo模型和VA模型的表现与验证集相似，分别为AUC 0.588（灵敏度=59.0%，特异性=73.7%）和0.554（灵敏度=38.5%，特异性=78.9%）（图5C）。因此，与LUNG-TRAC相比，Mayo模型和VA模型在验证和单中心测试中的AUC得分显著较低，提示LUNA-TRAC的总体性能显著由于这两个常用的肺结节恶性风险分层模型。
图5：LUNG-TRAC、Mayo、VA和前三者合并建立的模型（Combined）在（A）验证集，（B）单中心测试集和（C）多中心测试集中对肺结节cfDNA样本良恶性预测结果的ROC曲线和AUC值。（D）合并模型对训练集、验证集和单中心测试集中良性肺结节和肺癌患者cfDNA样本的恶性程度预测值的分布情况，和良性-恶性结节样本之间分值差异的显著性。
「结语」
LUNG-TRAC肺结节恶性风险预测和分层模型经过了包括使用前瞻性队列的多中心测试在内的多轮验证和测试后，证明了具有较高的特异性同时保持较好的灵敏度。因此该模型能够帮助临床医生减少对良性结节患者的不必要的干预，特别是减少对肺结节患者生活质量产生不利影响的侵入性手术，同时发现并及时治疗恶性或高风险肺结节病例，从而从整体上改善所有肺结节患者的临床结果，更有效地利用现有临床资源。
「参考文献」
[1] Y. Li et al., "Non-invasive diagnosis of pulmonary nodules by circulating tumor DNA methylation: A prospective multicenter study," Lung Cancer, vol. 195, p. 107930, Sep 2024.
[2] T. National Lung Screening Trial Research et al., "Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening," N Engl J Med, vol. 365, no. 5, pp. 395-409, Aug 4 2011.
[3] S. J. Swensen, M. D. Silverstein, D. M. Ilstrup, C. D. Schleck, and E. S. Edell, "The probability of malignancy in solitary pulmonary nodules. Application to small radiologically indeterminate nodules," Arch Intern Med, vol. 157, no. 8, pp. 849-55, Apr 28 1997.
[4] M. K. Gould et al., "Recent Trends in the Identification of Incidental Pulmonary Nodules," Am J Respir Crit Care Med, vol. 192, no. 10, pp. 1208-14, Nov 15 2015.
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